橙皮素具有抗炎，抗菌，抗氧化，抗過(guò)敏，抗病毒，抗細(xì)菌，抗原生動(dòng)物，抗真菌和抗致癌作用可預(yù)防骨質(zhì)流失的作用。橙皮素是橙皮苷脫掉了一分子鼠李糖和葡萄糖的水解產(chǎn)物，其藥效基本與橙皮苷相似，但其溶解性較好，通過(guò)橙皮苷酶酶解橙皮苷而得到的橙皮素的抗癌活性在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。目前，橙皮素主要應(yīng)用于食品和醫(yī)藥，化妝品。近年來(lái)，隨著橙皮素研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)橙皮素對(duì)信血管疾病化有著較好的預(yù)防和治療的作用，國(guó)外利用化學(xué)法生產(chǎn)橙皮素的工藝已經(jīng)很成熟，目前國(guó)內(nèi)橙皮素主要是作為一種藥物原料在使用，相關(guān)的藥物物具有保健等療效，但生產(chǎn)技術(shù)不是很成熟，因此，橙皮素的生產(chǎn)有較大的空間。

橙皮苷酶是一種由鼠李糖苷酶和葡萄糖苷酶組成的復(fù)合酶，主要來(lái)自青霉和黑曲霉。橙皮苷經(jīng)過(guò)該酶的作用后可以轉(zhuǎn)化為橙皮素單葡萄糖苷和橙皮素。在橙皮苷的生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中，橙皮苷酶起到很重要的作用，所以生產(chǎn)高活力的橙皮苷酶成為制備橙皮苷水解產(chǎn)物的關(guān)鍵。

本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)橙皮苷酶的枳實(shí)內(nèi)生真菌及其制備方法和應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人從新鮮枳實(shí)果實(shí)中采用內(nèi)生真菌分離純化技術(shù)分離得到一株產(chǎn)橙皮苷酶的枳實(shí)內(nèi)生真菌，通過(guò)SDS法提取本發(fā)明菌株的DNA，采用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增片段并測(cè)序，序列經(jīng)Genbank中Blast同源性比對(duì)，結(jié)果表明本菌株與溜曲霉（Aspergillus tamarii）同源性最高，相似性為99%，可以判定本菌株為溜曲霉（Aspergillus tamarii），命名為溜曲霉（Aspergillus tamarii）ZS002，已于2019年06月28日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC NO.18105，保藏地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

本發(fā)明的枳實(shí)內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)橙皮苷酶的方法，包括如下步驟：

S1、將溜曲霉（Aspergillus tamarii）ZS002接種到PDA斜面培養(yǎng)基中活化96 ~120 小時(shí)，并制作孢子懸浮液，然后接種至液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，25~35℃，100~200 r/min培養(yǎng)48~96 小時(shí)，然后在10000 r/min，4℃條件下冷凍離心10 min，收集上清液即為橙皮苷酶的初酶液;其中液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：每升培養(yǎng)基中含馬鈴薯150~250 g，蔗糖10~20 g，胰蛋白胨5~15 g，磷酸氫二鉀2~4 g，橙皮苷2~6 g，其余為水，調(diào)節(jié)pH 為5.0~7.0；

 S2、取步驟S1中的初酶液，按照5%用量加入含0.1 mg/mL橙皮苷的磷酸二氫鈉?磷酸氫二鈉的緩沖溶液（0.02 mol/L，pH為5.0），然后在35℃、轉(zhuǎn)速180 r/min條件下培養(yǎng)1小時(shí)，即得含有橙皮苷酶的培養(yǎng)液。

選取適量大小相等且無(wú)病害的新鮮枳實(shí)，有蒸餾水清洗干凈;將所得枳實(shí)在無(wú)菌條件下用75％的酒精浸泡120 秒，無(wú)菌水沖洗3次; 然后用10％的次氯酸鈉浸泡60秒，再用無(wú)菌水沖洗6次。無(wú)菌條件下用最后一遍沖洗的無(wú)菌水涂布于PDA平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)后無(wú)微生物長(zhǎng)出，表明表面消毒徹底。然后將消毒后的的枳實(shí)用粉碎機(jī)將枳實(shí)進(jìn)行粉碎，將枳實(shí)的粉末置于培養(yǎng)皿中，加無(wú)菌水使其潤(rùn)濕，然后置于培養(yǎng)箱中，通過(guò)自然固態(tài)發(fā)酵，使其霉變。

然后取適量自然霉變的枳實(shí)粉末，用無(wú)菌水制成菌懸液，用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋，用涂布平板法接種于PDA平板，待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長(zhǎng)出時(shí)間的不同，分別挑取各平板上的菌落邊緣的菌絲接于含橙皮苷濃度5g/L為的查氏固體培養(yǎng)基在30℃分離培養(yǎng)4d，挑取長(zhǎng)勢(shì)較好的菌落，經(jīng)反復(fù)劃線獲得枳實(shí)內(nèi)生真菌，采用劃線法進(jìn)行多次的分離純化，獲得可以轉(zhuǎn)化橙皮苷的枳實(shí)內(nèi)生菌純培養(yǎng)物。

通過(guò)SDS法提取所得枳實(shí)內(nèi)生菌純培養(yǎng)物中菌株的DNA，采用通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增片段并測(cè)序，序列經(jīng)Genbank中Blast同源性比對(duì)，結(jié)果表明本菌株與溜曲霉（Aspergillus tamarii）同源性最高，相似性為99%，可以判定本菌株為溜曲霉（Aspergillus tamarii）。

本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)：利用微生物產(chǎn)生的酶作催化劑催化橙皮苷轉(zhuǎn)化生成橙皮素，反應(yīng)效率高、專一性強(qiáng)、副產(chǎn)物少、步驟簡(jiǎn)單、綠色環(huán)保無(wú)污染。