目前，核酸酶是生物學(xué)、化學(xué)和醫(yī)學(xué)研究中被廣泛使用的工具。它們被廣泛應(yīng)用于生物傳感器、基因編輯技術(shù)和新藥物的研制上。不同的核酸酶具有不同的切割特性，對(duì)應(yīng)的底物也各不相同。在實(shí)際應(yīng)用的層面，目前對(duì)核酸酶的應(yīng)用都是基于其可以預(yù)測(cè)的工作機(jī)制。例如，我們通常希望Endo IV能夠穩(wěn)定且專一地切割具有空位的DNA雙鏈。然而，核酸酶容易受到體系中其他核酸鏈的干擾，其切割特性并不穩(wěn)定。尤其是對(duì)于以雙鏈DNA為靶目標(biāo)鏈的核酸酶，它們經(jīng)常非特異性地切割核酸單鏈。這一現(xiàn)象往往導(dǎo)致意料之外的串?dāng)_，對(duì)核酸酶在各個(gè)領(lǐng)域的應(yīng)用形成很大的限制。

 在酶-核酸探針領(lǐng)域，廣泛使用的lambda exonuclease，APE1和Endo IV均易發(fā)生預(yù)料之外的非特異酶切現(xiàn)象，嚴(yán)重限制了酶-探針檢測(cè)體系的實(shí)際應(yīng)用。因?yàn)樵诿?探針檢測(cè)體系中，不與野生鏈結(jié)合的核酸探針以單鏈的形式大量存在。如果核酸酶切割單鏈核酸探針，熒光信號(hào)就會(huì)作為背景信號(hào)大量產(chǎn)生，導(dǎo)致突變鏈和野生鏈之間的區(qū)分度減少甚至消失。這對(duì)于一個(gè)檢測(cè)體系來說是不可接受的。針對(duì)這一問題，目前并沒有簡明有效的方法。

通過上述分析，現(xiàn)有技術(shù)存在的問題及缺陷為：(1)核酸酶切割單鏈的現(xiàn)象普遍存在且嚴(yán)重干擾酶-核酸探針體系的正常工作，降低檢測(cè)效能；(2)該現(xiàn)象難以預(yù)測(cè)，目前的方法只能是盲目的優(yōu)化探針序列以盡可能地避免核酸酶對(duì)單鏈探針的自切割，導(dǎo)致成本極高。

解決以上問題及缺陷的難度為：核酸酶在DNA雙鏈和DNA單鏈上的分配機(jī)理尚不明確。抑制核酸酶副活性的同時(shí)需要保持核酸酶主活性不受影響。

解決以上問題及缺陷的意義為：提供了一種全新的抑制核酸酶副活性的方法，擴(kuò)大了核酸酶的應(yīng)用范圍；保證酶-探針體系正常工作，使檢測(cè)效能保持穩(wěn)定；避免當(dāng)前方法中盲目優(yōu)化探針序列的環(huán)節(jié)，降低了成本。

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供了一種對(duì)核酸酶活性進(jìn)行特異性調(diào)控的方法。可應(yīng)用于核酸信號(hào)放大、單核苷酸多態(tài)性(SNP)分型以及低豐度點(diǎn)突變檢測(cè)等技術(shù)領(lǐng)域。

本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的，一種對(duì)核酸酶活性進(jìn)行特異性調(diào)控的方法，在抑制核酸酶副活性的同時(shí)不影響核酸酶主活性，保證酶-探針體系正常工作，使檢測(cè)效能保持穩(wěn)定，包括：

步驟一，對(duì)不同突變位點(diǎn)的基因序列，設(shè)計(jì)相應(yīng)的Guiding鏈；

步驟二，合成制備所需的Guiding鏈；

步驟三，將Guiding鏈與探針檢測(cè)體系混合，使Guiding鏈與底物鏈的比例為2:1；

步驟四，向上述混合體系加入Endo IV，使底物鏈轉(zhuǎn)化為長度更長的DNA雙鏈，并進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測(cè)定。

步驟一設(shè)計(jì)Guiding鏈的方法包括：

步驟1，確定底物鏈的探針雜交域，所述底物鏈為待檢測(cè)的目標(biāo)序列；

步驟2，設(shè)計(jì)兩條DNA單鏈，所述DNA單鏈為Guiding鏈，使兩條Guiding鏈其與底物鏈的探針雜交結(jié)構(gòu)域外的部分互補(bǔ)，一起構(gòu)成核酸酶優(yōu)先結(jié)合的長雙鏈結(jié)構(gòu)。

本發(fā)明所具備的優(yōu)點(diǎn)如下：

本發(fā)明提供了一種全新的抑制核酸酶副活性的方法，擴(kuò)大了核酸酶的應(yīng)用范圍；在抑制核酸酶副活性的同時(shí)不影響核酸酶主活性，保證酶-探針體系正常工作，使檢測(cè)效能保持穩(wěn)定；避免當(dāng)前現(xiàn)有方法中因核酸酶副活性導(dǎo)致的盲目優(yōu)化探針序列的環(huán)節(jié)，降低了成本。

本發(fā)明針對(duì)不同突變位點(diǎn)的基因序列，按上述原則設(shè)計(jì)相應(yīng)的Guiding鏈；合成制備所需的Guiding鏈；將Guiding鏈與探針檢測(cè)體系混合，使Guiding鏈與底物鏈的比例為2:1；向上述混合體系加入Endo IV，立即進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光測(cè)定，由于底物鏈已被轉(zhuǎn)化為長度更長的DNA雙鏈，核酸酶副活性被抑制；涉及的調(diào)控內(nèi)切酶IV(Endo IV)/APE-1/lambda外切酶(lambda exo)活性，降低了由于核酸酶副活性而產(chǎn)生的背景信號(hào)，同時(shí)最大程度的保留核酸酶切割目標(biāo)序列的主活性，從而提高檢測(cè)效能。