煙草是我國重要的經濟作物，但田間易受多種病害的威脅，其中根莖部土傳病害危害嚴重，導致煙草的產量和品質下降，嚴重制約我國煙草產業(yè)的發(fā)展。煙草上分布較廣的重要土傳病害包括煙草疫霉引起的黑脛病、假茄科雷爾氏菌引起的青枯病、立枯絲核菌引起的立枯病、尖孢鐮刀菌引起的根腐病以及基生根串珠霉引起的根黑腐病等，這五種病害發(fā)病早期隱蔽性強，發(fā)病癥狀比較類似，并且待發(fā)病明顯時多已難以救治，田間很難從癥狀上準確區(qū)分，容易導致誤診而無法有效控制病害蔓延。另外，土傳病害易發(fā)生復合侵染，增加病害診斷和防治的難度。因此，建立一種能夠在早期對多種煙草土傳病原菌進行快速、準確、高效的檢測方法有助于控制煙草土傳病害帶來的嚴重損失。常規(guī)檢測方法主要是對病株進行分離鑒定，其分離難度大，靈敏度低，耗時長，難以滿足生產上的需求。血清學檢測易出現假陽性反應且一次只能檢測一種病原。

近年來，隨著分子生物學的發(fā)展，已有很多PCR相關技術運用在植物病害的快速檢測方面。如利用環(huán)介導等溫技術擴增實現了對假茄科雷爾氏菌的快速分子鑒定。利用巢式PCR實現了對煙草疫霉的快速鑒定。利用UP?PCR分子技術實現了對立枯絲核菌的快速鑒定。利用比較基因組學的方法，建立了尖孢鐮刀菌的多重PCR檢測體系。用多重PCR技術實現了對煙草疫霉和煙草根腐病的快速檢測。但田間煙草土傳病原菌種類較多，建立同時檢測更多病原菌種類的技術將提高檢測效率和應用價值。

多重PCR技術是在同一反應體系中加入多對特異性引物，同時擴增出多個核酸片段的PCR反應，其原理與常規(guī)PCR相同。在病害研究中，主要應用于多種病原物的同步檢測。與常規(guī)PCR相比，多重PCR具有成本低、檢測效率高等優(yōu)點。目前也有運用多重PCR檢測煙草病原菌的報道，但不同煙草種植區(qū)域病害種類有所不同，病原菌分布不一致，需要根據當地病害發(fā)生情況設計相應病原菌組合的多重PCR體系。

在多重PCR分子檢測技術中，為每個目的病原菌設計出特異性引物，保證各病原菌引物之間沒有交叉反應是成功的關鍵。另外，引物擴增片段的大小應存在一定差異，便于區(qū)分。其次，引物濃度對多重PCR擴增也很重要，必須保證所有的引物具有相似的擴增效率。

廣西高溫高濕的氣候特點特別有利于多種煙草土傳病害的發(fā)生，以黑脛病和青枯病為主，另外還有立枯病、根腐病、根黑腐病等在局部區(qū)域分布。本研究建立了一種同時檢測更多病原菌種類的多重PCR方法，能夠同時檢測田間病株和土壤中煙草黑脛病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌，對混合DNA檢測的靈敏度達到了100pg/µL，進一步提高了檢測效率，可以更好地服務于當地煙草農業(yè)生產。

本發(fā)明的目的在于提供一種同時檢測煙草黑脛病、青枯病、立枯病、根腐病和根黑腐病的引物組、試劑盒及其應用，能夠同時快速檢測煙草黑脛病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑腐病菌以及田間帶菌煙草病株和土壤，為田間煙草根莖部病害的早期診斷和有效防治提供依據。

 本發(fā)明篩選引起五種根莖部病害的病原菌的特異性引物組合，通過不同的引物濃度和退火溫度對多重PCR體系進行優(yōu)化，檢測體系的靈敏度，并對土壤和植株樣品進行測試，驗證其實用性，能夠同時快速檢測煙草黑脛病菌、青枯病菌、立枯病菌、根腐病菌和根黑?1腐病菌以及田間帶菌煙草病株和土壤，對混合DNA檢測的靈敏度達到了100pg.µL ，可以為煙草土傳病害以及同種病原菌引起的其他作物病害的快速診斷、早期監(jiān)測預警以及防控提供有力依據，具有較高的應用前景。